2TK1分子量验证:取10份TK1阳性和5份TK1阴性血清,40%硫酸铵沉淀,取上清液透析,再进行WesternImmunoblottinhg,结果TK1阳性血清在分子量25000处均有显色条带,TK1阴性血清无显色。
二、标准曲线的制作不同含量标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),经过点免疫印迹发光法测定后,用GS700图像扫描仪测定各斑点的A值,以标准品浓度值为横坐标,A值为纵坐标制作标准曲线(图1)。
三、重复性试验
两份乳腺肿瘤患者血清,应用点免疫印迹发光法在同一NCM上重复测定20次,结果:病例1的TK1含量为194pmol/L,标准差为12;病例2血清的TK1含量为49pmol/L,标准差为21,两者的批内CV分别为0.062和0.043。
四、标本检测各组人群血清TK1的含量比较见表1;用点免疫印迹发光法检测血清的X线片结果见图2。
五、乳腺肿瘤患者术后TK1的动态变化对1例乳腺良性肿瘤患者手术后0、26、37ｄ的血清进行检测,TK1分别为9.1、2.5、4.9pmol/L;而另1例淋巴结未转移的乳腺癌患者术后0、21、28、65、77、92ｄ的血清TK1分别为91.8、39.7、50.7、20.2、17.5、3.8pmol/L。结果表明,当患者完全康复时,TK1呈明显下降趋势。
讨论
正常人细胞中TK1的含量极低,只是在细胞过度增生的情况下,才出现高的水平,Ellime等[3]报道,恶性贫血患者血清中TK的含量是正常人的40倍,且能作为一些癌症发生、发展和预后的重要指标。我们利用抗TK1mAb,建立点免疫印发光法检测乳腺肿瘤患者血清中TK1,通过对方法特异性、重复性的考查,以及经WesternImmunoblottinhg的验证,表明该方法简便易行,可用于血清TK1的检测。
从本研究结果看,乳腺癌患者血清TK1水平明显高于乳腺良性肿瘤患者,而后者与体检健康者TK1无明显差别(Ｐ＞0.05),对于淋巴结未转移的乳腺癌患者,手术后TK1水平呈明显下降的趋势。因此,血清TK1不仅可以作为乳腺癌诊断的一个敏感性指标,而且也有利于乳腺癌的疗效观察。虽然乳腺癌患者血清TK1水平明显高于对照人群,但是乳腺癌患者间TK1水平也有差别,可能与肿瘤细胞分化程度和所处细胞周期及肿瘤是否转移有关,有待进一步研究。
血清TK1的来源仍不十分清楚,而且它比细胞内提取的TK1更稳定,同时,血清TK1的水平与肿瘤的性质有关,因此,有学者[4]推测,血清TK1可能是肿瘤细胞分泌或溶解释放胸苷激酶的聚合体。
国外已有报道,应用酶法[3]和WesternBlotting[2]检测血清中TK1,且能进行定量分析。但因这些方法操作繁琐,难以用于临床。我们认为点免疫印迹发光法容易操作,而且利用了发光技术的高灵敏性,通过X线片曝光,避免了使用发光检测仪,且可长期保存实验结果;通过设立标准品对照,根据斑点的深浅进行定量分析。因此,点免疫印迹发光法检测血清TK1可作为乳腺肿瘤诊断方法之一,尤其判断良恶性乳腺肿瘤具有很好的应用前景。
