3主要试剂和仪器:TK1单克隆抗体,生物素标记的羊抗鼠抗体(bioantiM),辣根过氧化物酶标记亲和素(avidinHRP),TK1标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),鲁米诺发光底物和X线片均由瑞典Karolinska大学提供。GS700图像扫描仪为美国BioRad公司产品。
二、方法
1点样,在NCM上每点加血清5μl,同时设立标准品对照(每次测定NCM都有标准品),室温晾干,洗涤3次,每次5min。将NCM37℃振荡封闭2ｈ,加入适量的TK1单抗于封闭液中,4℃振荡过夜,漂洗3次,将NCM放于BioantiM液中,室温振荡作用1ｈ,洗涤同前。加入适当浓度的avidinHRP于NCM容器中,室温1ｈ,洗涤4次。将NCM置于新鲜配制的发光底物中,室温1min,用塑料膜将NCM封好,排除气泡,装于密封夹内,暗室中放入X线片,曝光3min(30min内完成),取片冲洗。
2结果分析,用GS700图像扫描仪测定各斑点的吸光度值(A),以标准品的含量对应A值作图进行定量分析,凡是TK1浓度大于5pmol/L可判定为异常;也可通过肉眼观察定性分析,斑点颜色深于5pmol/L标准品,即为TK1阳性。
三、WesternImmunoblottinhg检测血清TK1详细操作方法参见有关文献[2]。
结果
一、特异性
1对照实验:取1份TK1阳性血清,分别设立TK1单抗、BioantiM及avidinHRP空白对照,经点免疫印迹发光法测定,发现三者对照点均不显色。
2TK1分子量验证:取10份TK1阳性和5份TK1阴性血清,40%硫酸铵沉淀,取上清液透析,再进行WesternImmunoblottinhg,结果TK1阳性血清在分子量25000处均有显色条带,TK1阴性血清无显色。
二、标准曲线的制作不同含量标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),经过点免疫印迹发光法测定后,用GS700图像扫描仪测定各斑点的A值,以标准品浓度值为横坐标,A值为纵坐标制作标准曲线。
