1960年胸腺嘧啶核苷激酶(TK)被证实是胸腺嘧啶核苷(简称胸苷)合成DNA的关键酶,随后的研究表明[1],TK有两种同工酶,为细胞质TK(TK1)和线粒体TK(TK2),其中TK1与细胞分裂密切相关,在细胞分裂G1期含量比较低,到S期后逐渐升高,至G2期达到最高,因此,编码TK1的mRNA及其表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。目前,实验室主要采用放射免疫法(RIA)检测血清TK的酶活性,由于125I标记脱氧尿嘧啶半衰期短,且具有放射性污染,难于在临床上推广。1996年He等[2]报道利用抗TK1多克隆抗体,建立westernblotting检测人TK1。在此基础上,我们利用抗TK1单克隆抗体,建立点免疫印迹发光法检测乳腺肿瘤患者血清中TK1,可用于乳腺肿瘤诊断、疗效观察、预后及肿瘤病理机制的研究,在鉴定良、恶性乳腺肿瘤取得了良好效果,现初步报告如下。
材料和方法
一、材料
1研究对象:共检测118例患者,其中乳腺肿瘤患者75例,来源于湖北医科大学附属第一医院和Karolinska医院,经病理学确诊,乳腺癌61例(手术前患者14例,淋巴结未转移的手术后患者37例,淋巴结转移的手术后患者10例),乳腺良性肿瘤14例;对照组43例,其中11名为本院体检健康者,32例为本院非肿瘤住院患者(乳腺炎10例,乙型肝炎12例,肺结核10例)。所有研究对象采集静脉血,分离血清,贮存于-20℃备用。
2硝酸纤维素薄膜(NCM),孔径0.45μm,规格10cm×8cm,浙江黄岩四青生化材料厂生产。
3主要试剂和仪器:TK1单克隆抗体,生物素标记的羊抗鼠抗体(bioantiM),辣根过氧化物酶标记亲和素(avidinHRP),TK1标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),鲁米诺发光底物和X线片均由瑞典Karolinska大学提供。GS700图像扫描仪为美国BioRad公司产品。
二、方法
1点样,在NCM上每点加血清5μl,同时设立标准品对照(每次测定NCM都有标准品),室温晾干,洗涤3次,每次5min。将NCM37℃振荡封闭2ｈ,加入适量的TK1单抗于封闭液中,4℃振荡过夜,漂洗3次,将NCM放于BioantiM液中,室温振荡作用1ｈ,洗涤同前。加入适当浓度的avidinHRP于NCM容器中,室温1ｈ,洗涤4次。将NCM置于新鲜配制的发光底物中,室温1min,用塑料膜将NCM封好,排除气泡,装于密封夹内,暗室中放入X线片,曝光3min(30min内完成),取片冲洗。
